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      細胞污染問(wèn)題分析與解決

       更新時(shí)間:2020-10-15 點(diǎn)擊量:1177

       

      細胞污染問(wèn)題分析解決

      細胞轉染時(shí),細胞狀態(tài)的好壞對轉染效率有很大影響。細胞污染可能會(huì )導致細胞死亡,本文主要總結了細胞培養中常見(jiàn)污染現象和解決方法。

      凡是對細胞生長(cháng)有危害的成分或者造成細胞不純的異物都視為污染。細胞污染根據污染源可以分為化學(xué)污染,物理污染和生物污染。本文主要描述微生物污染的現象及解決方法

      微生物污染

      1. 細菌:細菌污染常見(jiàn)的有大腸桿菌,葡萄球菌等。細菌污染較易發(fā)現,在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀,培養液一般會(huì )在短時(shí)間內變黃,有時(shí)靜置的培養液不混,稍加震蕩,變會(huì )有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見(jiàn)培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮,有時(shí)在細胞表面及周?chē)写罅考毦嬖?,細胞停止生長(cháng)并有中毒表現。

      處理:① 在培養液中加入相應的抗生素,能夠預防絕大多數的細菌污染

      ②保證器皿、水充分滅菌,空氣無(wú)菌,同時(shí)保證滅菌壓力。
      2、霉菌:霉菌的污染多數是白色念珠菌, 曲霉菌,酵母菌等。霉菌污染后培養液短期內依舊清亮不變渾濁,倒置顯微鏡下可看見(jiàn)細胞之間有交錯的絲狀,樹(shù)枝狀菌絲,漂浮在培養液中。念珠菌呈卵圓狀,在細胞周邊生長(cháng)。細胞被霉菌污染后,仍可生長(cháng),長(cháng)時(shí)間細胞的活力狀態(tài)會(huì )變差。

                 

      處理:先確定污染物的種類(lèi):細菌、真菌還是支原體。如果是霉菌污染。迅速將污染細胞與正常細胞系隔離,并對實(shí)驗中所用過(guò)的所有器皿工具消毒

      3、支原體:支原體的大小介于細菌和病毒之間,是一種獨立生活的微生物。對熱敏感,對一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變,多吸附在細胞表面和細胞之間。電鏡下觀(guān)察,中心有高密度的密集顆粒,橫斷面與細胞微絨毛相似。

      因國內的血清很多數都沒(méi)有做支原體陰性檢測,而支原體又是牛血清中常見(jiàn)的微生物之一。支原體污染細胞后,培養液輕微發(fā)生混濁.但細胞變化不顯著(zhù),在細胞逐漸的培養中,細胞會(huì )慢慢死亡。

      支原體污染檢測:

      熒光染色法:DNA和與DNA特異性結合的熒光染料結合,使得支原體的DNA著(zhù)色,然后用熒光顯微鏡觀(guān)察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。

       

      解決:① 抗生素排除法:支原體污染預防比解決好。如果不小心污染后,可加入高濃度抗生素(常規使用的5倍濃度)作用24-48小時(shí),再換入常規培養液,但該法不保證有效。推薦用量:慶大霉素 200ug/ml ,四環(huán)素10ug/ml ,卡那霉素50ug/ml 。

      2 加溫除菌:支原體不耐熱,可以對支原體污染的細胞熱處理除菌。將支原體污染的細胞放置41度中作用10小時(shí)可殺死支原體。因高溫對細胞本身也會(huì )產(chǎn)生一定影響,故熱處理前需行預實(shí)驗,確定對細胞影響小而能大程度的殺死支原體的時(shí)間。
      4、黑蛟蟲(chóng):黑膠蟲(chóng)污染后細胞中出現小黑點(diǎn),高倍鏡下可看見(jiàn)不規則的運動(dòng)。培養液渾濁不明顯,對細胞生長(cháng)狀態(tài)無(wú)太大影響。

      解決:如果細胞出現黑膠蟲(chóng)污染,可增加細胞的接種密度,提高細胞存活率。當細胞生長(cháng)狀態(tài)很好時(shí),黑膠蟲(chóng)的數量會(huì )降低。細胞培養過(guò)程中堅持要每天換液,并用緩沖液沖洗,能夠大大降低黑膠蟲(chóng)的數量,可終消失,偶爾在鏡下可見(jiàn)個(gè)別小黑點(diǎn),但整體細胞培養和后續的細胞轉染無(wú)影響。

      細胞培養箱染菌清洗方法

      用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內,再把水盤(pán)里也加上飽和量的硫酸銅?;蛘咴谂囵B箱的托盤(pán)加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
      CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有細胞暫時(shí)轉移,采用過(guò)氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。并把過(guò)氧乙酸放置在孵箱內一個(gè)小時(shí),使其蒸汽彌漫。待過(guò)氧乙酸的氣味消散后,再移入細胞。孵箱應定期清潔(2月左右)。
      其它培養箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外燈照。
      預防霉菌污染,可在培養基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線(xiàn)菌素D或雙抗;但細胞一旦污染,制霉菌素或放線(xiàn)菌素D或雙抗都無(wú)法彌補,舍棄被污染細胞,并將環(huán)境*消毒。如果所有細胞都污染,可能是整體系統污染,檢查所有培養基和器材,并重新滅菌。針對個(gè)別污染,先考慮操作問(wèn)題,注意操作規范。

       

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