各種轉染試劑中文說(shuō)明

一、PEI Prime Powder, Transfection Grade Linear Polyethylenimine(Serochem)轉染步驟（以 HEK293 貼壁細胞為例）

1.細胞接種：細胞密度 2-6 x106 cells/mL.

2.質(zhì)粒的準備：在 5％最終培養體積的 DMEM 或培養基中，每 10 6 個(gè)細胞稀釋1.0 ug pDNA。

3. PEI 的準備：在 5％最終培養體積的 DMEM 或培養基中，每 10 6 個(gè)細胞稀釋3.0 ug PEI Prime，混勻通過(guò)快速，短暫渦旋或顛倒數次試管，將 pDNA 和 PEI Prime 溶液混合在一起。

4. 使 pDNA 和 PEI 的混合物在室溫下靜置 10 分鐘。一邊旋轉板，一邊將 pDNA 和 PEI 混合物逐漸滴加到細胞中。

5.于 37℃ CO₂ 培養箱中培養。

二、Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 轉染步驟：

說(shuō)明：以下步驟適用于在 6 孔培養板中轉染貼壁細胞。開(kāi)始時(shí)，每 6 孔培養板使用 0.4ug DNA。盡管 DNA 的量看起來(lái)很少，但已足夠用于轉染。如果想獲得最高的轉染效率，對每種細胞系的轉染條件都要進(jìn)行優(yōu)化。

轉染前一天，用 5ml 含血清和抗生素的培養基分裝使每 6 孔培養板含 2-8×105的細胞（根據細胞類(lèi)型而定）。在細胞的正常培養條件下培養（通常 37℃和 5％CO2）。轉染當天細胞應 40-80％融合。轉染時(shí)，用 DNA 濃縮緩沖液（EC Buffer）稀釋 1ug DNA 至 100ul 總體積（DNA 用 pH 7-8 的 TE Buffer 溶解，DNA 濃度：0.1ug/ul）。加入 3.2ul Enhancer， 渦旋 1s 以混合溶液。

重要：請保持 DNA 與 Enhancer 比例恒定。

 注意：質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量會(huì )顯著(zhù)影響幾個(gè)轉染參數如轉染效率、細胞增殖和細胞毒性、以及對于結果的解釋。因此，只應該使用最高純度的 DNA。室溫（15-25℃）孵育 2-5 分鐘，離心（spin down）幾秒鐘以從管頂去除液滴。向 DNA-Enhance 混合液中加入 10ul Effectene Transfection Reagent，反復吸取 5

次或渦旋 10 秒鐘以混合。

注意：沒(méi)必要一直把 Effectene Reagent 置于冰上。在室溫中放置 10-15 分鐘不會(huì )改變它的穩定性。

室溫下（15-25℃）孵育 5-10 分鐘以形成轉染復合物。孵育過(guò)程中，從培養板上輕柔地吸出培養液，用 4ml PBS 洗滌一次細胞。加入1.6ml 新鮮培養液（可以包含血清和抗生素）到細胞中。加入 0.6ml 培養液（可以包含血清和抗生素）至包含轉染轉染復合物的 EP 管中。吸取兩次以混合，立即將轉染復合物 drop-wise 加入 6 孔培養板的細胞中。輕搖培養板使轉染復合物分布均勻。將細胞與轉染復合物在它們的正常培養條件下孵育適當的時(shí)間直至轉染基因表達。孵育時(shí)間和由所采用的實(shí)驗和所使用的基因決定。

Optional: 大多數情況下，不需去除轉染復合物。然而，如果觀(guān)察到細胞毒性，則需在轉染后 6-18 小時(shí)移除 Effectene-DNA 混合物，用 PBS 洗滌一次細胞， 然后加入 5ml 新鮮細胞培養液。

瞬時(shí)轉染時(shí)，進(jìn)一步試驗分析轉染基因的表達。

轉染β-gal 或 cat 報告基因的重組子常在轉染后孵育 24-48 小時(shí)以使轉染基因的表達。

穩定轉染時(shí)，在轉染后 24-48 小時(shí)，將細胞以 1:5~1:10 傳代至合適的選擇性培養基中。保持細胞在選擇性培養基中直至克隆出現。

注意：我們推薦對每一細胞系和使用的抗生素建立一個(gè)致死曲線(xiàn)（劑量-反應曲線(xiàn)）。但是一定要記住致死曲線(xiàn)受細胞密度的影響。

以下步驟有時(shí)是必須的：將轉染的細胞置于它們正常的培養液（如：不含選擇性抗生素的培養液），然后孵育 1-2 天，然后再加入選擇性培養液。